阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD），又叫老年性痴呆，是一种神经退行性疾病，其临床表现包括渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状，严重影响社交、职业与生活功能。AD的病因和发病机制尚未阐明，大量证据显示AD与β淀粉样蛋白（Aβ）沉积形成的老年斑和Tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结有关。

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由于AD的发病机制尚不清楚以及药物不能穿过血脑屏障（BBB），故目前缺乏一种有效的诊断和治疗方法。2019年4月11日，《Nanoscale》杂志在线刊登了锦州医科大学赵亮、梁佳、史一杰课题组的最新重要工作，他们设计了一种特殊的药物载体—外泌体，它能够携带姜黄素（cur），可在体内外预防神经元死亡，减轻AD症状。研究人员阐释了用姜黄素处理细胞分泌的外泌体（Exo-cur）通过受体介导的胞吞作用，能够高效穿过血脑屏障，抑制Tau蛋白磷酸化，在AD治疗中具有改善药物靶向传递和神经元功能恢复的巨大潜力（图1）[1]。

 图1 本研究的主要构思

实验结果

用cur处理小鼠白血病单核巨噬细胞系（RAW 264.7），收集细胞培养上清，分离得到Exo-cur。用外泌体蛋白标志物进行鉴定，证实Exo-cur的确由RAW 264.7分泌（图2C），同时在Exo-cur中检测到了淋巴细胞功能相关抗原1（LFA-1）的大量表达。携带了LFA-1的Exo-cur可以作为靶向内皮细胞ICAM-1和穿过血脑屏障的药物载体。随后通过一系列鉴定方法得出Exo和Exo-cur都具有正常的形态特征和大小（100nm左右）（图2A-B、2D），这些特征表明外泌体的性质不受修饰的影响。

采用透析袋法从外泌体中释放cur，结果显示（图2E），free-cur的释放速度较快，4 h内获得65.7%的快速累积释放，24h内达到86.7%。与此相反，外泌体还可以控制cur的缓慢平稳释放，并且超过85.6%的cur在24h内从外泌体缓慢泄漏到培养基中。

图2 Exo-cur的特征与功能研究

为了确定将cur包裹入外泌体中是否能增加cur的溶解度，研究人员设置了free-cur和Exo-cur两个组，且两组都带有相同数量的cur，连续摇动30min。结果显示，Exo-cur溶解度（18.5μg/mL）相对游离组（1.8μg/mL）提高了10倍（图3A）。由于cur在水溶液中极易水解或降解，free-cur的降解速率明显高于PBS和Exo-cur（图3B）。这些结果表明，与游离的cur相比，加载到外泌体后，cur的溶解度和稳定性得到了提高。

为了评估外泌体装载cur之后是否能增加cur的生物利用度，研究人员以SD大鼠为研究对象，采用静脉注射free-cur和Exo-cur评价其药代动力学特征。结果表明，注射了free-cur的大鼠，其血浆中cur的最大浓度（Cmax）在注射5min后达到峰值（0.52ug/mL），然后迅速降低；注射了Exo-cur的大鼠，其Cmax在注射2h后达到峰值（0.91ug/mL）。通过曲线下面积（AUC）、半衰期（t1/2）、全身清除率（CL）观察，发现Exo-cur能促进cur更高的生物利用度和降低其代谢速度（图3D）。

随后研究人员分析了cur在不同器官的分布情况（图3C），结果显示，cur主要积累在脑部，且Exo-cur组的cur积累量是free-cur组的6.5倍，其次，cur也积累在肝脏和肺部。之后再通过组织学差异进一步分析注射free-cur和Exo-cur对SD大鼠的整体毒性情况（图3E），结果发现，注射free-cur和Exo-cur后，两组主要器官的组织学无明显差异，即不会引起明显毒性，因此Exo-cur可能是AD治疗的安全载体。 

图3 外泌体包裹cur增加了其溶解度和稳定性

为了体外评估Exo-cur是否具有较高的靶向性，研究人员选用了脑微血管内皮细胞系（hCMEC/D3）考察free-cur和Exo-cur的细胞吸收率和血脑屏障的主要成分。通过共培养实验和荧光共聚焦拍摄（图4A），研究人员发现free-cur组细胞的绿色荧光强度很弱，细胞吸收cur量很少，而Exo-cur组的荧光强度较强，cur吸收量较多。为了进一步验证Exo-cur组cur较高的吸收量是否与外泌体表面LFA-1和内皮细胞ICAM-1的特异性结合有关，研究人员将Exo-cur用2mg/mL ICAM-1进行预处理，再与细胞进行共培养。实验发现，Exo-cur吸收率明显受抑制。此数据表明Exo-cur选择性结合到有ICAM-1的细胞表面，且能促进Exo-cur进入到细胞内部。

随后，研究人员通过使用酶标仪检测下室中cur的荧光强度来评估free-cur组和Exo-cur组穿过血脑屏障的渗透率。结果显示（图4B），60%以上的Exo-cur都能穿过血脑屏障层，并且在6h以内就能检测到，而free-cur组只有15%能穿过。同时实验发现，Exo-cur表面LFA-1和ICAM-1对血脑屏障的穿过有明显的促进作用。

图4 Exo-cur能体外提高细胞吸收率和跨血脑屏障效率

为了监测free-cur和Exo-cur在大脑中的分布情况，研究人员将free-cur和Exo-cur通过腹腔注射分别注射到C57BL/6小鼠中，实验结果表明（图5A），在处理6h和24h之后，脑区内能观察到Exo-cur处理组中cur的荧光强度增强，而free-cur处理组的荧光强度减弱。随后，研究人员进一步检测free-cur和Exo-cur是否能靶向传递到海马，数据显示（图5B）了在海马区域Exo-cur处理组中由cur发出的绿色荧光强度比free-cur处理组更强。之后通过脑组织切片证明了Exo-cur已被传递到大脑海马中的神经元细胞中（图5C）。因此，这些数据表明，Exo-cur能增强体内大脑海马中cur的积累，这有助于其发挥神经保护作用。

图5 在C57BL/6小鼠模型中cur积累在脑组织的海马区域

由于海马神经元的存活与AD治疗的良好结果密切相关，所以我们最终评估Exo-cur治疗效果是看其是否可以减少海马神经元损伤。观察海马中的活神经元细胞并通过用NeuN染色来计数。结果显示（图6），使用OA诱导成AD后，与假手术组相比，OA组的海马神经元细胞受损严重，同时海马CA1区、CA3区和DG区的NeuN阳性细胞数量明显减少。有趣的是，Exo-cur组在海马CA1区、CA3区和DG区的NeuN阳性细胞多于OA组和OA+cur组。数据表明，Exo-cur治疗可有效减少OA诱导的神经元损伤。 

图6 在海马CA1区、CA3区和DG区中神经元阳性细胞的免疫荧光染色

研究人员连续7天每天向OA诱导的AD模型鼠分别单次腹腔注射生理盐水、exo、free-cur和Exo-cur，同时体内的治疗效果通过莫里斯水迷宫测试进行检测（图7A）。结果显示，从第一天到第五天，OA治疗组的逃避潜伏期明显长于假手术组，假手术组与OA治疗组有显著性差异(P <0.01)（图7B）。同时，实验进一步说明了注射OA会损害小鼠的记忆和空间学习能力。但是在OA诱导的AD小鼠模型中，注射Exo-cur能显着改善小鼠的记忆和空间学习能力（图7C、D、E）。因此，在改善AD模型小鼠的学习和记忆障碍方面，Exo-cur可被认为比free-cur更有效。

图7 Exo-cur可改善OA处理小鼠的认知缺陷

研究人员通过WB分析了Exo-cur在OA介导的海马细胞死亡中的作用。结果显示（图8B），OA加重了海马神经元的损伤，且在海马注射OA可显著增强细胞凋亡的效果。随后，实验数据说明Exo-cur可显著降低OA诱导的神经细胞的细胞毒性，从而表明其通过提高神经元存活率对AD小鼠具有显着的神经保护作用。

为了检测Exo-cur对OA诱导的Tau蛋白过度磷酸化的保护作用，研究人员分析了OA组和假手术组的p-Tau（Ser396）表达水平。数据显示，OA组p-Tau（Ser396）表达水平高于假手术组（P <0.01）。然而，Exo-cur处理组诱导的Tau磷酸化比OA组低。因此，Exo-cur抑制了OA诱导的Tau蛋白磷酸化。

为了进一步研究Exo-cur如何调控Tau磷酸化，研究人员通过WB检测相关的蛋白表达量。文献报道GSK-3β参与Tau蛋白磷酸化，当GSK-3β被激活时，Ser9的残基会脱去磷酸化，从而诱导Tau蛋白磷酸化；AKT是一个潜在的GSK-3β上游调节因子，AKT激活后会通过提高GSK-3β（Ser9）磷酸化水平抑制GSK-3β的激活。实验发现，OA组会引起GSK-3β激活，而Exo-cur组会抑制OA诱导的GSK-3β蛋白激活（图8B）。与假手术组相比，OA组AKT磷酸化水平显著降低(P < 0.01)，这意味着OA可引起AKT的失活，而Exo-cur组中AKT磷酸化水平明显高于OA组(P < 0.01)。因此，研究人员发现，Exo-cur组中AKT能保护cur不受OA诱导的GSK-3β激活和Tau磷酸化的影响（图8）。

图8 Exo-cur对OA诱导AD小鼠模型的体内治疗机制

上面的实验已经证实了Exo-cur通过AKT/GSK-3β信号通路抑制了Tau蛋白磷酸化，从而改善AD小鼠的认知功能。然而，由巨噬细胞分泌的naïve Exo在AD的发病机制中尚不清楚。随后，研究人员通过一系列实验发现（图9A），虽然Exo对AD小鼠认知障碍的改善作用有限，且低于Exo-cur组，但注射Exo仍对降低OA诱导的记忆障碍和提高AD小鼠的空间学习能力具有协同作用。据文献报道，巨噬细胞分泌的Exo与细胞的炎症密切相关，同时Tau蛋白磷酸化也会引起神经验证和神经损伤。研究人员推测，由于Exo可能与炎症的调控相关，那么其对OA诱导的记忆损伤的减轻可能是通过阻止OA诱导的小胶质细胞过度活化和减少OA引起的海马凋亡反应来减轻神经炎症。实验结果显示，Exo可以进入大脑的小胶质细胞中（图9B）。此外，OA可诱导小胶质细胞活化，通过加速小胶质细胞释放神经毒性促炎因子，导致其神经毒性（图9C）。与OA组相比，Exo显著降低了Iba -1阳性细胞的数量和密度，同时WB和免疫荧光染色实验也发现（图9D、9E），在OA诱导的AD小鼠模型中，海马组织里的Iba -1水平升高，而Exo处理后明显降低了Iba-1的表达水平。研究人员进一步发现（图9F），Exo处理可在体内抑制小胶质细胞的异常活化，并能通过抑制OA诱导的海马凋亡反应，有效减少OA诱导的神经元损伤。

图9 Naïve Exo通过减轻小胶质细胞过度活化和减少OA诱导的神经元细胞凋亡，从而缓解OA诱导的AD小鼠认知功能下降

与free-cur相比，cur与Exo结合后提高了cur的溶解度、稳定性和生物利用度。由于外泌体LFA-1与内皮细胞ICAM-1的相互作用，外泌体可以通过血脑屏障进入大脑并且在海马区分布着大量的外泌体cur。研究人员接着发现Exo-cur通过AKT/GSK-3β通路抑制Tau磷酸化，有助于改善OA诱导的AD小鼠的学习和记忆缺陷，这些发现为Exo-cur治疗AD的潜在临床效益提供了进一步的证据。

●一文读懂国自然科研热点：外泌体

●【Nature Neuroscience】新机制！Aβ与tau“狼狈为奸”共同恶化AD发生发展

●【Neuron】当补体免疫系统遇上AD：一场“最漫长的告别”

参考文献：

[1] Curcumin-primed exosomes potently ameliorate cognitive function in AD mice by inhibiting hyperphosphorylation of the Tau protein through the AKT/GSK-3β pathway. Nanoscale. 2019 Apr 11;11(15):7481-7496.